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급속하고 얼룩이 진다

Nature Biomedical Engineering 7권, 페이지 1040–1052(2023)이 기사 인용 4259 액세스 110 Altmetric Metrics 세부 정보 플라크 분석 - 농도를 측정하는 최적의 표준 방법

Nature Biomedical Engineering 7권, 페이지 1040–1052(2023)이 기사 인용

4259 액세스

110 알트메트릭

측정항목 세부정보

복제 능력이 있는 용해성 비리온의 농도를 측정하기 위한 표준 방법인 플라크 분석법에는 염색이 필요하며 일반적으로 48시간 이상의 실행 시간이 필요합니다. 여기에서는 렌즈 없는 홀로그램 이미징과 딥 러닝을 결합하여 분석을 신속하게 진행하고 자동화할 수 있음을 보여줍니다. 컴팩트한 이미징 장치는 웰당 시간당 약 0.32기가픽셀의 속도로 위상 정보를 라벨 없이 캡처하고 약 30 × 30mm2의 영역을 포괄하며 표준 분석보다 10배 더 큰 동적 바이러스 농도 범위를 가지며 감염된 바이러스를 정량화합니다. 면적과 플라크 형성 단위의 수. 수포성 구내염 바이러스의 경우 자동화된 플라크 분석은 배양 후 5시간 만에 바이러스 복제로 인한 첫 번째 세포 용해 현상을 감지했으며 20시간 이내에 플라크 형성 단위를 100%에서 90% 이상의 비율로 감지했습니다. 특성. 또한 단순 포진 바이러스 1형의 잠복기는 약 48시간, 뇌심근염 바이러스의 잠복기는 약 20시간 단축됐다. 무염색 분석법은 바이러스 연구, 백신 개발 및 임상 진단에 사용할 수 있어야 합니다.

바이러스 감염은 인플루엔자, 인간 면역결핍 바이러스, 인간 유두종 바이러스1와 같은 전염병을 통해 전 세계적으로 수백만 명의 사람들에게 영향을 미칠 수 있습니다. 미국 질병통제예방센터(CDC)는 2010년 이후 인플루엔자 바이러스로 인해 미국에서만 1,600만~5,300만 건의 질병이 발생하고 20만~100만 명이 입원했으며 16,700~66,000명이 사망한 것으로 추산했습니다2,3. 더욱이, 전 세계적으로 5억 명 이상의 감염자와 600만 명 이상의 사망을 초래한 코로나19 팬데믹은 많은 국가의 공중 보건과 사회 경제적 발전에 막대한 부담을 가져왔습니다4. 이러한 글로벌 보건 과제에 대처하는 데 도움을 주기 위해서는 임상 진단5, 백신 개발6 및 재조합 단백질7 또는 항바이러스제8,9 생산을 위한 정확하고 저렴한 바이러스 정량 기술을 개발해야 합니다.

1952년에 개발된 플라크 분석법은 바이러스 농도를 정량화하는 최초의 방법이었습니다. Renato Dulbecco가 발전한 이 분석법을 사용하면 복제 가능 용해성 비리온10,11이 포함된 특정 샘플에서 플라크 형성 단위(PFU)의 수를 수동으로 결정할 수 있습니다. 이러한 샘플은 연속적으로 희석되고, 각 희석의 분취량은 배양된 세포 접시에 추가됩니다. 바이러스가 인접한 세포를 감염시키고 확산됨에 따라 점차적으로 플라크가 형성되며 전문가가 육안으로 검사할 수 있습니다. 비용 효율적인 방식으로 바이러스 샘플의 감염성을 제공하는 고유한 기능으로 인해 플라크 분석은 다른 방법의 존재에도 불구하고 바이러스 농도를 정량화하는 최적의 표준 방법으로 남아 있습니다12,13,14,15,16,17 ,18,19, 면역형광 초점 형성 분석14, 중합효소 연쇄 반응16 및 효소 결합 면역분석 기반 분석19,20 등이 있습니다. 그러나 플라크 분석은 일반적으로 플라크가 눈에 보이는 크기로 확장될 수 있도록 2~14일(바이러스 유형 및 배양 조건에 따라)의 잠복기가 필요하며 수동 플라크 계수 과정에서 인적 오류가 발생할 수 있습니다22. 전통적인 플라크 분석법을 개선하기 위해 수많은 방법이 개발되었습니다. 많은 시스템에는 웰 플레이트에서 세포 배양을 이미지화할 수 있는 고유한 기능이 있지만 형광 마커또는 금 미세 전극이 있는 특수 배양 플레이트가 필요합니다. 또한, 이러한 방법에는 인간 계산 오류가 여전히 문제로 남아 있습니다. 따라서 정확하고 정량적이며 자동화되고 신속하며 비용 효율적인 플라크 분석은 바이러스 연구 및 관련 임상 적용에 유리할 것입니다.

정량적 위상 이미징(QPI), 홀로그래피 및 딥 러닝의 최근 개발 중 일부는 이러한 요구를 해결할 수 있는 기회를 제공합니다. QPI는 비침습적이고 라벨이 없는 방식으로 투명한 생물학적 표본의 시각화 및 정량화를 가능하게 하는 탁월한 이미징 기술입니다. 또한 QPI 시스템의 이미지 품질은 특히 위상 검색27, 노이즈 감소28, 자동 초점29,30 및 공간 해상도31을 개선하여 신경망을 사용하여 향상될 수 있습니다. 또한 QPI32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42를 사용하여 수많은 딥러닝 기반 미생물 탐지 및 식별 방법이 나타났습니다.

90% PFU detection rate in <20 h, providing major time savings compared with the traditional plaque assays, which take ≥48 h. Furthermore, we show an average incubation time saving of ~48 h and ~20 h for HSV-1 and EMCV, respectively, achieving a PFU detection rate >90% with 100% specificity. A quantitative relationship was also developed between the incubated virus concentration and the virus-infected area on the cell monolayer. Without any extra sample-preparation steps, this deep-learning-enabled label-free PFU imaging and quantification device can be used with various plaque assays in virology and might help to expedite research in vaccine and drug development./p>95% coverage. During the virus infection, five wells were infected by 100 µl of the diluted VSV suspension (obtained by diluting a 6.6 × 108 PFU ml−1 VSV stock with a dilution factor of 2−1 × 10−6), and one well was left for negative control. Then, 2.5 ml of the overlay solution containing the total medium with 4% agarose was added to each well (see Methods for details, ‘Preparation of agarose overlay solution’). After the solidification of the overlay at room temperature, each sample was first placed into our imaging set-up for 20 h of incubation, performing time-lapse imaging to capture the spatiotemporal information of the sample. Then, the same sample was left in the incubator for an additional 28 h to let the PFUs grow to their optimal size for the traditional plaque assay (this is only used for comparison purposes). Finally, each sample was stained using crystal violet solution to serve as the ground truth to compare against our label-free method./p>90% at 20 h of incubation without having any false positives at any time point despite using no staining./p>1%), a faster PFU concentration readout can be provided at 12 h or 15 h. As the size of an average PFU on the well is physically larger at 15 h of incubation compared with 12 h, the slope of the red calibration curve in Fig. 6b is smaller than in Fig. 6a, as expected. For samples with even higher virus concentrations, the infected cell area percentage could reach >1% in ≤10 h of incubation (shown in Fig. 5c), providing the PFU concentration readout even earlier./p>70 °C during its operation, which could disturb the growth of the sample and vaporize the agarose layer, especially for regions that are near the sensor parking location between successive holographic scans. Hence, a cooling system was built using fans (QYN1225BMG-A2, Qirssyn). We also sealed the sides of the sample using parafilm (product number 13-374-16, Fisher Scientific) and opened four holes on the top cover to form a gentle ventilation system, which is an inexpensive and easy-to-implement solution to avoid sample drying./p>90% detection rate for VSV PFUs with 100% specificity in <20 h./p>11 TB) is available from the corresponding author on reasonable request./p>